Антинуклеарный фактор на HEp-2 клетках

Метод исследования с использованием человеческих эпителиальных клеток HEp-2, который позволяет обнаружить антинуклеарные антитела – один из маркеров системных заболеваний соединительной ткани.

Синонимы русские

АНФ, антиядерные антитела, антинуклеарные антитела (АНА).

Синонимы английские

Antinuclear Antibodies (ANA), Hep-2 Substrate, ANA-Hep2, Fluorescent AntiNuclear Antibody detection (FANA).

Метод исследования

Непрямая реакция иммунофлюоресценции.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Определение антинуклеарного фактора (АНФ) является «золотым стандартом» выявления антинуклеарных антител (АНА) и диагностики аутоиммунных заболеваний.

Патогенез системных заболеваний соединительной ткани (СЗСТ) тесно связан с нарушениями в иммунной системе и повышенной выработкой антител к структурам собственных клеток. Аутоантитела к компонентам ядра клеток – антинуклеарные антитела – взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и белками ядра, антигенами цитоплазмы, что проявляется воспалительными изменениями в тканях и органах, болями в суставах и мышцах, выраженным утомлением, потерей веса, кожными изменениями. АНА обнаруживаются при многих аутоиммунных заболеваниях, но наиболее характерны для системной красной волчанки (СКВ). АНА встречаются более чем у 90 % больных системными заболеваниями соединительной ткани, в настоящее время описано около 200 разновидностей, которые объединены единым названием – антинуклеарный фактор.

При определении АНФ методом непрямой флюоресценции чаще используется перевиваемая линия эпителиальных клеток аденокарциномы гортани человека НЕр-2. Клетки НЕр-2 являются очень удобным субстратом для лабораторного исследования, так как обладают крупными ядрами и на стеклах растут в один слой. АНА выявляются при связывании с внутриклеточными антигенами клеток НЕр-2.

При исследовании эпителиальные клетки НЕр-2 выращивают на стеклах, фиксируют и инкубируют с разведенной сывороткой крови пациента. После удаления избытка сыворотки клетки инкубируют с меченными флюоресцеином антителами, затем снова промывают и исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа. При этом определяется титр антител и тип свечения. Диагностически значимым считается титр более 1:160. При обострении ревматических заболеваний он превышает 1:640, а в период ремиссии снижается до 1:160-1:320. Чем больше антител, тем выше титр. По типу свечения можно установить мишени антинуклеарных антител, что имеет важное клиническое значение и определяет тактику дальнейшего обследования пациента. Основными являются периферический, гранулярный (мелко-/крупно-), ядрышковый, центромерный и цитоплазматический типы окрашивания ядра. Каждому типу свечения присущи очень характерные признаки, которые позволяют отличить один вариант от другого.

Гомогенное (диффузное) окрашивание связано с наличием антител к двуспиральной ДНК, гистонам и характерно для СКВ и лекарственной волчанки.

Периферическое свечение обусловлено периферическим распределением хроматина в ядре, связано с антителами к ДНК и специфично для СКВ. Данный тип свечения важно дифференцировать от окрашивания ядерной мембраны, которое происходит при аутоиммунных заболеваниях печени.

Гранулярное (крапчатое, сетчатое) окрашивание встречается наиболее часто и является наименее специфичным, выявляется при многих аутоиммунных заболеваниях. Аутоантигенами в данном случае выступают нуклеопротеиновые комплексы в ядре (Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B антигены и PCNA).

Очень высокие титры АНФ с крупногранулярным типом свечения часто указывают на смешанное заболевание соединительной ткани.

Нуклеарное (ядрышковое) окрашивание обусловлено антителообразованием к компонентам ядрышка (PHК-полимераза-1, NOR, U₃RNP, PM/Scl), выявляется при склеродермии, болезни Шегрена. АНА иногда повышаются при эндокринных заболеваниях (сахарном диабете 1-го типа, тиреоидите, тиреотоксикозе, полиэндокринном синдроме), кожных заболеваниях (псориазе, пузырчатке), при беременности, после трансплантации органов и тканей, у больных на гемодиализе.

Центромерное свечение появляется при наличии антител к центромерам хромосом и характерно для формы склеродермии – CREST-синдрома.

Цитоплазматический тип свечения связан с антителами к тРНК-синтетазе, в частности к Jo-1, что характерно для дерматомиозита и полимиозита. Данный тип окрашивания также определяется при наличии антител к другим компонентам цитоплазмы при аутоиммунном гепатите, первичном билиарном циррозе.

Одновременное выявление различных типов свечения указывает на присутствие разных видов антител.

У здоровых людей может быть обнаружено мелкогранулярное свечение при низких, умеренных или высоких титрах АНА, но в норме крупнозернистые или гомогенные типы свечения не должны определяться.

В зависимости от результатов оценки типа свечения разрабатывается дальнейшая тактика лечения пациента и назначаются дополнительные исследования, уточняющие спектр АНА.

Для чего используется исследование?

• Для диагностики системных заболеваний соединительной ткани.
• Для дифференциальной диагностики ревматических болезней.
• Чтобы оценить эффективность терапии аутоиммунных заболеваний.
• Для наблюдения за течением системных заболеваний соединительной ткани.

Когда назначается исследование?

• При симптомах аутоиммунного заболевания (длительное повышении температуры, боли в суставах, усталость, потеря массы тела, изменение кожных покровов).
• При выявлении изменений, характерных для системных заболеваний соединительной ткани (повышение СОЭ, уровня С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов).

Что означают результаты?

Референсные значения

Результат: отрицательно.

Титр: 1:160.

Причины повышения титра АНФ на HEp-2 клетках:

• cистемная красная волчанка (в 95 % случаев),
• дерматомиозит/полимиозит,
• системная склеродермия (в 60-90 % случаев),
• синдром Шегрена (в 40-70 % случаев)
• смешанное заболевание соединительной ткани (синдром Шарпа),
• синдром Рейно,
• дискоидная волчанка,
• лекарственная волчанка,
• ревматоидный артрит,
• некротизирующий васкулит,
• инфекционный мононуклеоз,
• лейкемия,
• злокачественные новообразования (преимущественно лимфома),
• тяжелая миастения,
• инфекционный эндокардит,
• хронический аутоиммунный гепатит,
• первичный билиарный цирроз печени,
• туберкулез,
• пневмокониоз,
• интерстициальный фиброз легких.

Типы свечения

Что может влиять на результат?

• Ложноположительному результату способствует:

• • возраст старше 60-65 лет (в 10-37 % случаев);
  • применение лекарственных препаратов, которые могут привести к лекарственной волчанке (ацетазоламид, карбидопа, хлоротиазид, хлорпромазин, клофибрат, этосуксимид, соли золота, гризеофульвин, гидралазина, изониазида, соли лития, метилдопа, пероральные контрацептивы, пенициллин, фенилбутазон, фенитоин, примидон, прокаинамид, пропилурацил, хинидин, резерпин, стрептомицин, сульфаниламид, тетрациклин, тиазидные диуретики).

• Прием глюкокортикостероидов (преднизолон, дексаметазон, метипред) иногда приводит к ложноотрицательному результату.

Важные замечания

• В 5 % случаев СКВ возможен отрицательный результат данного анализа (АНФ-отрицательная СКВ). В таких ситуациях для уточнения диагноза необходимо определить антитела к SS-антигенам (Ro).
• Положительный результат теста не является абсолютным доказательством наличия аутоиммунного заболевания. У здоровых людей в 3-13 % случаев титр АНФ повышен и достигает 1:320.
• Результаты теста необходимо оценивать в комплексе с клиническими данными и другими лабораторными показателями.
• При положительном результате исследования рекомендовано определить специфичность АНА иммуноблотом.

Также рекомендуется

• Антитела к двухцепочечной ДНК (анти-dsDNA), скрининг
• Антитела к ядерным антигенам (ANA), скрининг
• Антитела к экстрагируемому ядерному антигену (ENA-скрин)
• Антитела к кардиолипину, IgG и IgM
• Антинуклеарные антитела (анти-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENT-B, Jo-1, к гистонам, к нуклеосомам, Ribo P, AMA-M2), иммуноблот
• Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)

Кто назначает исследование?

Ревматолог, иммунолог.

Литература

• Wilson D. McGraw-Hill Manual of Laboratory and Diagnostic Tests 1st Ed Normal, Illinois, 2007: 55-57 pp.
• Mariz HA, Sato EI, Barbosa SH, Rodrigues SH, Dellavance A, Andrade LE. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 2011 Jan;63(1):191-200.
• Kumar Y, Bhatia A, Minz RW. Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. Diagn Pathol. 2009 Jan 2;4:1. PMID: 19121207 [PubMed].